26. člen
(splošno)
a)
Načelo metode
V reakciji, ki jo katalizira encim citrat liaza (CL), se citronska kislina pretvori v oksalacetat in acetat.
&fbco;binary entityId="0a7f6e52-09ec-4b7c-934b-7b274dc6e8ea" type="gif"&fbcc;
V prisotnosti malat dehidrogenaze (MDH) in laktat dehidrogenaze (LDH) se oksaloacetat in njegovi dekarboksilacijski derivati ter piruvat reducirajo z reducirano obliko nikotinamid adenin dinukleotidom (NADH) v L-malat in L-laktat:
&fbco;binary entityId="528d1fa6-b185-428d-9f57-67d1f06e4e59" type="gif"&fbcc;
Pri teh reakcijah je količina NADH, ki se oksidira v NAD(na +), sorazmerna s količino prisotnega citrata. Oksidacija NADH se določi z zmanjšanjem absorbcije pri valovni dolžini 340 nm.
b)
Reagenti
-
Puferska raztopina pH 7,8 (0,51 M raztopina glicilglicina; pH 7,8; Zn(na 2+) (0,6 x 10(na -3) M):
7,13 g glicilglicina raztopimo v približno 70 ml dvakrat destilirane vode. pH uravnamo na 7,8 s približno 13 ml 5 M raztopine natrijevega hidroksida, dodamo 10 ml raztopine cinkovega klorida (80 mg ZnCl(2) v 100 ml H(2)O) in dopolnimo z dvakrat destilirano vodo do 100 ml.
-
Raztopina reduciranega nikotinamid adenin dinukleotida (NADH) (približno 6 x 10(na -3) M): 30 mg NADH in 60 mg NaHCO(3) raztopimo v 6 ml dvakrat destilirane vode.
-
Raztopina malat dehidrogenaze/laktat dehidrogenaze (MDH/LDH, 0,5 mg MDH/ml, 2,5 g LDH/ml): zmešamo 0,1 ml MDH (5 mg MDH/ml), 0,4 ml raztopine amonijevega sulfata (3,2 M) in 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Pri 4 °C je ta suspenzija stabilna najmanj eno leto.
-
Citrat liaza (CL, 5 mg protein/ml): 168 mg liofilizata raztopimo v 1 ml ledeno mrzle vode. Ta raztopina ostane stabilna pri 4 °C najmanj en teden in najmanj štiri tedne, če je zmrznjena.
Pred določanjem je priporočljivo preveriti aktivnost encimov.
-
Polivinilpolipirolidon (PVPP)
Opomba: Vsi zgoraj omenjeni reagenti so dostopni komercialno.
c)
Analitska oprema
-
Spektrofotometer, ki omogoča meritve pri 340 nm, t.j. pri valovni dolžini, pri kateri je absorpcija NADH največja.
Lahko pa se uporablja tudi sprektrofotometer z več viri svetlobe, ki omogoča meritve pri 334 nm ali 365 nm.
Ker merimo absolutno absorpcijo (ne uporabljamo umeritvenih krivulj, ampak opravimo standardizacijo z upoštevanjem ekstrakcijskega koeficienta NADH), je treba preveriti lestvice valovnih dolžin in spektralne absorbance opreme.
-
Steklene kivete z debelino optične plasti 1 cm ali plastične kivete za enkratno uporabo.
-
Mikropipete za dodajanje količin v območju volumnov od 0,02 do 2 ml.
d)
Priprava vzorca
Določanje citrata se običajno izvede neposredno v vinu brez predhodne odstranitve pigmentacije (barvil) in brez razredčevanja, če je koncentracija citronske kisline manjša od 400 mg/l. Če je večja, vino razredčimo, dokler koncentracija citrata ni od 20 do 400 mg/l (t.j. od 5 in 80 mikrog citrata v testnem vzorcu).
Rdeča vina vsebujejo veliko fenolnih spojin, zato se priporoča predhodna obdelava s PVPP.
Napravimo vodno suspenzijo približno 0,2 g PVPP in pustimo stati 15 minut. Prefiltriramo s filtrom v obliki lija.
10 ml vina damo v 50 ml erlenmajerico, dodamo vlažen PVPP, ki ga s filtra odstranimo s spatulo. Tresemo dve do tri minute. Filtriramo.
e)
Postopek
S spektrofotometrom pri valovni dolžini 340 nm določimo absorpcijo na celicah velikosti 1 cm, pri čemer zrak uporabljamo kot slepi vzorec za referenčno absorpcijo (na poti žarka ni nobene celice). V celico velikosti 1 cm damo naslednje:
-----------------------------------------------------------------
referenčna vzorčna
celica (ml) celica (ml)
-----------------------------------------------------------------
Raztopina 2.1 1,00 1,00
Raztopina 2.2 0,10 0,10
Vzorec za meritev - 0,20
Dvakrat destilirana voda 2,00 1,80
Raztopina 2.3 0,02 0,02
-----------------------------------------------------------------
Mešamo in po približno petih minutah odčitamo absorpcijo raztopine v referenčni in vzorčni celici (A1).
Dodamo:
----------------------------------------------------------------- Raztopina 2.4 0,02 ml 0,02 ml -----------------------------------------------------------------
Mešamo in počakamo, dokler se reakcija ne konča (okrog pet minut) in odčitamo absorpcijo raztopin v referenčni in vzorčni celici (A(2)).
Izračunamo razliko absorpcij (A(2) – A(1)) za referenčno celico in celico z vzorcem, in dobimo DeltaAR in DeltaAS.
Na koncu izračunamo razliko med temi razlikami:
DeltaA = DeltaAR – DeltaAS
Opomba: Čas, ki je potreben, da se konča aktivnost encimov, se lahko od ene serije do druge razlikuje. Zgornja vrednost je samo referenca in jo je priporočljivo določiti za vsako posamezno serijo.
f)
Izražanje rezultatov
Koncentracija citronske kisline je izražena v miligramih na liter, zaokrožena na najbližje celo število.
1.
Postopek izračuna
Splošna formula za izračun koncentracije v mg/l je:
&fbco;binary entityId="b666a7e7-05ac-4bbd-a029-cf2d83358215" type="gif"&fbcc;
kjer je:
V = volumen testne raztopine v ml (tukaj 3,14 ml)
v = volumen vzorca v ml (tukaj 0,2 ml)
M = molekulska masa, ki jo določamo (tukaj M = 192,1 g/mol za brezvodno citronsko kislino)
d = dolžina optične poti v cm (tukaj 1 cm)
epsilon = absorpcijski koeficient NADH (pri 340 nm, e = 6,3 mmol(na -1) x 1 x cm(na -1),
zato je:
C = 479 x DeltaA
Če je bil vzorec med pripravo razredčen, rezultat pomnožimo s faktorjem razredčitve.
Opomba:
Pri 334 nm: C = 488 x DeltaA (= 6,2 m mol(na -1) x 1 x cm(na -1))
pri 365 nm: C = 887 x DeltaA (= 3,4 m mol(na -1) x 1 x cm(na -1))
2.
Ponovljivost (r)
Koncentracija citronske kisline, manjša od 400 mg/l: r = 14 mg/l
Koncentracija citronske kisline, večja od 400 mg/l: r = 28 mg/l
3.
Obnovljivost (R)
Koncentracija citronske kisline, manjša od 400 mg/l: R = 39 mg/l
Koncentracija citronske kisline, večja od 400 mg/l: R = 65 mg/l